188 Chapter 11 de afhankelijkheid van complexe en dure hulpstoffen. De afgelopen jaren hebben MS gebaseerde methoden daar verandering in gebracht. Deze methodes kunnen relatief snel worden ontwikkeld en gevalideerd. Ze hebben ook andere voordelen, zoals het meten van extreem lage concentraties, weinig last van storende stoffen en de mogelijkheid om verschillende eiwitten tegelijkertijd te meten, ook wel multiplexen genoemd. In Hoofdstuk 2 introduceren we een 6-stappen-handleiding voor het opzetten van een MS methode voor concentratiemetingen van therapeutische eiwitten in het algemeen. In dit hoofdstuk leggen we de verschillende strategieën uit voor het kwantificeren van therapeutische eiwitten in menselijk materiaal. Top-down, middle-down en bottom-up eiwitkwantificatie worden uitvoerig besproken en tot slot wordt de meest gebruikte techniek op basis van bottom-up eiwitkwantificatie beschreven met voor- en nadelen. Meten en monitoren van factor VIII met massaspectrometrie Vervolgens hebben we een MS methode voor het meten van de FVIII concentratie in het bloed opgezet. De ontwikkeling en validatie hiervan staan beschreven in Hoofdstuk 3. De voorbehandeling van de bloedmonsters begint met initiëren van de stollingscascade. Hierdoor werd FVIII vrijgemaakt van Von Willebrand factor en kwam actief FVIII beschikbaar om te meten. Vervolgens werd een selectiestap met zogenaamde nanobodies uitgevoerd om het actieve FVIII uit het bloedmonster te trekken en te isoleren. Hierna volgt een hitte behandeling om de eiwitten uiteen te laten vallen en wordt trypsine toegevoegd om de eiwitten in nog kleinere stukjes te knippen. Tot slot worden de monsters in het MS apparaat ingevoerd en gemeten. Alle validatieparameters waren ruim binnen de acceptatiecriteria van de vigerende Europese richtlijn voor bioanalytische methodevalidatie. De methode was succesvol opgezet en gevalideerd. Deze gevalideerde MS methode stelde ons vervolgens in staat om de relatie tussen de FVIII concentratie en FVIII activiteit te onderzoeken in Hoofdstuk 4. Een proof of principle onderzoek werd uitgevoerd op 87 bloedmonsters (restmateriaal) van personen met hemofilie A uit onze kliniek. In elk bloedmonster werd zowel de FVIII concentratie gemeten met behulp van de MS methode (Hoofdstuk 3) als de FVIII activiteit met behulp van een standaard stollingstest. De FVIII concentratie werd vergeleken met de FVIII activiteit. Een gemiddeld relatief verschil van -1% met een spreiding van 64% werd tussen de concentratie en activiteit aangetoond. Ondanks een goede algemene correlatie vertoonden enkele bloedmonsters een relatief groot verschil tussen de concentratie en de activiteit. Deze grote verschillen tussen concentratie en activiteit waren gecorreleerd aan de aanwezigheid van anti-FVIII antistoffen en het gebruik van FVIII producten (bijvoorbeeld uit plasma verkregen of gemodificeerde FVIII producten). De impact van deze grote verschillen is nog onduidelijk. Daarom is meer onderzoek nodig om de meerwaarde van FVIII concentratie in vergelijking met FVIII activiteit vast te stellen.
RkJQdWJsaXNoZXIy MTk4NDMw