393 Summary in Dutch A In hoofdstuk 10 creëerden we 8 stamcel lijnen, waarvan 6 personen drager zijn van de PLNR14del mutatie, en 2 gezonde familieleden. We toonden aan dat witte bloedcellen van deze personen efficiënt en met een lage dosering virale vectoren gereprogrammeerd konden worden tot stabiele stam cel lijnen. In alle lijnen werd een normaal chromosoompatroon geconstateerd, en alle stamcellen bezaten de benodigde pluripotente eigenschappen. Met deze 8 stamcel lijnen vergroten de stamcel biobank, om de onderzoeken voor het nabootsen van de PLN-R14del ziekte en therapeutische screenings te vergroten. In hoofdstuk 11 ontwikkelden we een protocol voor het maken, onderhouden en optisch analyseren van 3-dimentionale cardiale sferoïden (hCS) van hiPSC-CMs. Deze hCS zijn van micro-formaat en kunnen daardoor gekweekt worden in grote getalen voor ‘high-throughput’ screenings. We observeerden een homogene morfologie, grootte en maturatie, en daarnaast bezaten de hCS functionele calcium regulatie en contractie. We automatiseerden het protocol voor de hCS generatie tot screening, waardoor de batch-tot-batch reproduceerbaarheid van de calcium analyse werd verbeterd. Ten tweede hebben we een eenvoudige procedure beschreven voor het invriezen van intacte sferoïden, wat de mogelijkheid biedt voor een kant en klare biobank van vele patiënten voor het screenen van medicatie. We concluderen dat met behulp van dit protocol, functionele hCS van hoge kwaliteit geproduceerd kunnen worden die optimaal zijn voor het nabootsen van de PLN-R14del ziekte en therapeutische screening platformen. In hoofdstuk 12 gebruikten we het humane cardiale sferoïden (hCS) model uit hoofdstuk 11 om het moleculaire mechanisme van de PLN-R14del mutatie te onderzoeken. Hierbij vergeleken we hCS van gezonde individuen, een isogene controle (waarvan de mutatie is gecorrigeerd) en drie PLN-R14del patiënten. Opvallend was dat de PLN-R14del hCS een pathologische toename van de diameter tot wel 2.4-fold lieten zien. We observeerden een verminderde contractiliteit en calcium regulatie, mitochondriale dysfunctie, ophoping van vet druppels en ER/UPR-stress activering zoals al eerder beschreven in de PLN-R14del mutatie. Daarnaast observeerden wij met behulp van individuele cel sequencing, ook pathologische mechanismes die nog niet eerder beschreven waren in eerdere kweekmodellen. Zo toonden wij aan dat de PLN-R14del sferoïden een verhoogde fibroblast activering en extracellulaire matrix afscheiding gensets tot expressie brachten (zoals netrin-1) en receptor potentiaal kanaal genen. Deze bevindingen bevestigen het belang van fibrose voor de pathogenese van aritmogene/gedilateerde cardiomyopathieën en voor mogelijke therapeutische interventies. In deze laatste proefschrift studie, onthullen we PLN aggregaten, fibrose, en bleek de calcium regulatie verstoord, wat nog niet eerder is beschreven in vorige hiPSC-CMs studies. Tot slot bestudeerden we het therapeutische effect van een adeno associated virus (AAV)-gebaseerde inhibitor-1 (I-1c) gentherapie en toonden we een verbeterde calcium regulatie, contractie en een verminderde genexpressie van fibroblast activering aan. In dit hoofdstuk concludeerden we dat hCSs de pathologische fenotypes van de PLN-R14del ziekte bezitten en dat I-1c gentherapie gebruikt kan worden als een therapeutische optie voor de genezing van de PLN R14del cardiomyopathie.
RkJQdWJsaXNoZXIy MTk4NDMw