202 | Appendix spôsobuje zlomy DNA aj v génoch, ktoré nehrajú úlohu pri preskupovaní Ig segmentov, tzv. nežiadúca alebo „off-target“ aktivita? Čo ak by boli tieto nežiadúce zlomy navyše tiež opravené s chybami? Existuje súvislosť medzi „off-target“ aktivitou RAG1/2 a výskytom genetických chýb (mutácií, translokácií, delécií), ktoré tvoria základ pre vznik rakoviny B lymfocytov? Napríklad je možné predpokladať, že onkogén, ktorý sa nemôže „vypnúť“ v dôsledku nesprávne opravených zlomov DNA, by mohol viesť ku nekontrolovateľnému deleniu buniek. Akútna lymfoblastická leukémia (ALL) je typom krvnej rakoviny, ktorý sa vyznačuje rýchlym množením zhubných prekurzorov B a T buniek. ALL je charakterizovaná genomickou nestabilitou, vrátane translokácií ako ETV6-RUNX1, BCR-ABL1 a E2A-PBX1. Náznaky aktivity RAG1/2, alebo prítomnosť sekvencií pripomínajúcich RSS, boli zaznamenané v blízkosti genetických mutácii nielen v myšacích, ale aj v ľudských B-bunkových, vrátane ALL. Toto Tieto poznatky môžu naznačovať, že nepresná alebo chybná aktivita RAG1/2 by mohla zohrávať úlohu pri rozvoji lymfoidných malignít. Avšak presný mechanizmus malígnej transformácie prekurzorov B buniek, a úloha komplexu RAG1/2 v tomto procese, zostávajú v súčasnosti nepreskúmané. Výskum v tejto dizertačnej práci sa zameriava na detekciu a charakterizáciu nežiadúcej, „off-target“, aktivity RAG1/2 a jej možné dôsledky pre genomickú integritu. Dôkladne sme skúmali aj reguláciu komplexu RAG1/2 v kontexte poškodenia DNA a objavili sme niekoľko nových regulačných mechanizmov tohto komplexného procesu. V Kapitole 2 sme v aktuálnom prehľade literatúry podrobne opísali proces vývoja B buniek a rekombináciu génov V(D)J. Osobitnú pozornosť sme venovali úlohe poškodenia DNA a signálnej transdukcii, ktorú DNA poškodenie spúšťa. Popisujeme molekulárne mechanizmy zapojené do procesu rekombinácie génov V(D)J, mechanizmy udržiavania rovnováhy medzi poškodením a opravou DNA, ako aj možné dôsledky narušenia tejto rovnováhy. Sumarizujeme výsledky zo štúdií, ktoré ukazujú, že významná časť genetických chýb u pacientov s akútnou lymfoblastickou leukémiou B-buniek (B-ALL) vykazuje charakteristiky nežiadúcej aktivity RAG1/2, ktorá sa môže objaviť v dôsledku chybných regulačných mechanizmov. V úvode experimentálnej práce sme skúmali, či je aktivita komplexu RAG1/2 v prekurzoroch B buniek obmedzená len na Ig gény, alebo môže RAG1/2 tiež zavádzať zlomy DNA na iných miestach genómu. Predchádzajúci výskum iných autorov naznačuje, že komplex RAG1/2 by sa mohol viazať na DNA aj na iných miestach ako Ig gény. Avšak z týchto štúdií nie je jednoznačné, či väzba RAG1/2 na DNA taktiež vedie na týchto miestach k aktívnej tvorbe DNA zlomov. V Kapitole 3 sme preukázali, že RAG1/2 nespôsobuje DSB zlomy len v Ig génoch, ale aj na tisícoch ďalších miest v genóme. V bunkovej línii prekurzorov B buniek sme identifikovali približne 1500 miest, kde RAG1/2 aktívne vytvoril zlom DNA. Okrem predpokladanej aktivity na segmentoch Ig génov na chromozóme 6 (gény ľahkého reťazca imunoglobulínu u myší) a na chromozóme 12 (gény ťažkého reťazca imunoglobulínu u myší) sme identifikovali zlomy spôsobné aktivitou RAG1/2 naprieč celým genómom. DNA zlomy vyvolané aktivitou RAG1/2 boli identifikované v blízkosti génov, ktoré zohrávajú úlohu vo vývoji malignít, ako sú Ikzf4, Abl2, Klf4, Tcf4, Tcf7, Rassf8, Mef2c, alebo blízko génov zapojených do opravy zlomov DNA,
RkJQdWJsaXNoZXIy MTk4NDMw